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3.25 Prof. Dr. Wolfram Saenger

Institut für Kristallographie

Keywords: Protein X-ray crystallography, molecular biology, biochemistry, molecular dynamics, light scattering, DNA-binding proteins, photosystem I, oligosaccharides, hydrogen bonding, crystal nucleation.


Takustr. 6, 14195 Berlin, Tel. +49 30 838-53410, Fax -56702, E-mail: saenger@chemie.fu-berlin.de

Abstract

The main emphasis of our research is the structure determination of biological macromolecules at atomic detail by crystallographic methods. Proteins under study are: tetracyclin repressor and its complex with operator DNA, a DNA helicase, DNA methyltransferases, purine nucleoside phosphorylase, arylsulfatase, peptide synthetases, and the membrane protein complex photosystem I. Molecular biology and biochemistry are used in the production, purification and functional characterization of several of these proteins, and their biological activity is monitored by absorption, fluorescence and circular dichroism spectroscopy. After successful structure determination, functional mechanisms are studied by genetically mutating amino acid residues located in strategic positions ("protein design") and by theoretical methods (molecular dynamics). Work is also in progress on cyclodextrin inclusion complexes to study non-covalent intermolecular interactions and hydrogen bonding and on oligosaccharides of the starch and cellulose type. Since the crystallization of proteins is only poorly understood, aggregation of molecules and crystal nucleation are investigated by static and dynamic light scattering.

Wissenschaftlicher Werdegang

Studium: Chemie, Darmstadt, Heidelberg (1958-1964); Diplom: TH Darmstadt (1964); Promotion: TH Darmstadt (1965); Habil.: U. Göttingen (1971); Leiter der Röntgenstrukturanalyse am MPI für experimentelle Medizin, Göttingen (1967-1981); Berufung: FU Berlin, Lehrstuhl für Kristallographie (1981); Auslandsaufenthalte: Dept. of Chem., Harvard U., Cambridge, USA (1965-1967), je 6 bzw. 4 Wochen Gastprof. in Osaka/Japan (Jap. Soc. Promotion of Sciences) und in Cambridge/England (EMBO fellowship) (1979 und 1985); Auszeichn.: EMBO Mitglied (seit 1984); Leibniz-Preis (1988); A. v. Humboldt-Preis (1989); Mitglied der Berlin-Brandenburg. Akad. der Wissenschaften (seit 1994).

Kooperationspartner

Prof. H. T. Witt (TU Berlin), Prof. W. Hillen (Erlangen), Dr. E. Weinhold (Dortmund), Dr. Ch. Betzel (Hamburg), Dr. R. Giegé (Straßburg, Frankreich), Dr. I. Schildkraut (Beverly, USA), Dr. B. Kojic-Prodic (Zagreb, Kroatien), Prof. J.J.C. Teixeira-Dias (Aveiro, Portugal), Dr. P. Zielenkiewicz (Warschau, Polen).

Drittmittelgeber

DFG, Sfb 312, Sfb 344, DAAD, BMBF, EU, Fonds der Chemischen Industrie.

Forschungsgebiete

Bei unseren Forschungen stehen Fragen nach Struktur-Funktions-Beziehungen biologischer Makromoleküle im Vordergrund, die mit Röntgenkristallographischen Methoden bei atomarer Auflösung in Verbindung mit molekularbiologischen und biochemischen Arbeitsweisen geklärt werden. Hauptziele dieser Studien sind Proteine, die bei der Regulation der Genexpression (Sfb 344), bei der Photosynthese (Sfb 312) und bei der Peptidantibiotika-Synthese (EU-Projekt) wesentlich sind. Weitere Arbeiten beschäftigen sich mit Cyclodextrin-Einschlußverbindungen, um die in der Biologie entscheidenden nicht-kovalenten intermolekularen Wechselwirkungen und Wasserstoffbrücken-Bindungen modellmäßig zu erfassen und mit linearen Oligosacchariden des Stärke- und Cellulose-Typs, wobei Fragen nach Konformation und Selbstorganisation wichtig sind. Die bisher wenig verstandene Aggregation und Kristallisation von Proteinen wird mit Lichtstreu-Methoden untersucht. Im einzelnen:

Proteine, die bei der Regulation der Genexpression eine Rolle spielen.

Die Genexpression umfaßt alle Vorgänge, die bei der Umsetzung der genetischen Information in der Nukleotid-Sequenz der DNA in die entsprechende Aminosäure-Sequenz der Proteine eine Rolle spielen. Im weiteren Sinn betroffen sind außerdem die DNA-Replikation, die DNA-Methylierung und die Reorganisation von Genen bei der DNA-Rekombination, -Inversion, -Insertion, -Exzision. Letztere Prozesse werden von dem kleinen, 98 Aminosäuren langen Protein "Faktor für Inversions-Stimulierung, FIS" aus Escherichia coli beschleunigt. FIS liegt als Dimer vor, bindet an DNA und biegt diese ca. 90°, um sie in eine für verschiedene andere Proteine benötigte dreidimensionale Form zu bringen. Die Röntgenstrukturanalyse1 zeigt die Faltung der Polypeptidkette von FIS in 4 .alpha.-Helices A, B, C, D, von denen A, B und A', B' der beiden Monomere für die Dimerisierung wichtig sind, während C, D und C', D' Helix-Turn-Helix Motive bilden, die in benachbarte große Furchen der DNA binden. Da die beiden Motive im FIS-Dimer nur einen Abstand von 29 Å voneinander haben, während "gerade" DNA 34 Å erfordern würde, wird DNA gebogen, um an beide Motive gleichzeitig binden zu können.

Ein anderes Protein, der Tetrazyklin-Repressor, TetR, ist verantwortlich für die Regulation der Resistenz von Bakterien gegen das Breitband-Antibiotikum Tetrazyklin. In Abwesenheit von Tetrazyklin bindet TetR, der wiederum als Dimer vorliegt und dessen 208 Aminosäuren lange Polypeptidkette in 10 .alpha.-Helices gefaltet ist, mit zwei Helix-Turn-Helix Motiven an eine spezifische DNA-Sequenz (Operator) und verhindert damit die Expression eines Gens, dessen Produkt für die Resistenz verantwortlich ist2. Tritt Tetrazyklin in die Bakterienzelle ein, so bindet es an TetR und erzwingt eine Aufweitung des Abstands der Motive auf 39 Å, so daß eine Bindung an DNA (die 34 Å Abstand erfordert) nicht mehr stattfinden kann - damit wird das Resistenz-Gen freigegeben für die Expression. Abb. 1 zeigt die Struktur des TetR Dimers und die sehr spezifischen Wechselwirkungen zwischen TetR und Tetrazyklin. Letztere dienen als Grundlage für "Drug Design", um neue, die Resistenz unterlaufende Tetrazyklin-Derivate zu entwickeln. Mit molekularbiologischen Methoden wurde eine Reihe von Aminosäuren des TetR ausgetauscht und diese Varianten auf ihre Funktionsweise untersucht3.

Die spezifische Methylierung der Nukleotide Adenosin (A) und Cytidin (C) wird von der Biologie benutzt, um den Informationsgehalt der DNA zu steigern und ist bei verschiedenen Regulationsprozessen wichtig. Von uns wurde das Enzym DNA-Methyltransferase aus Thermus aquaticus (M.TaqI) untersucht, das die aktivierte Methylgruppe des Cofaktors S-Adenosylmethionin auf die Aminogruppe N(6) des Adenins in der spezifischen Nukleotidsequenz TCGA überträgt. Die Polypeptidkette des 421 Aminosäuren langen M.TaqI ist in ein komplexes System von .alpha.-Helices und .beta.-Faltblättern organisiert. Die Struktur besteht aus 2 Domänen, von denen eine für die Katalyse und die andere für die Erkennung und Bindung der spezifischen DNA-Sequenz verantwortlich ist4. Für die Übertragung der Methylgruppe muß Adenosin aus der Doppelhelix ausklappen; der noch unverstandene chemische Mechanismus der Methyl-Übertragung wird mit molekularbiologischen Methoden hinterfragt.


Abb. 1. (Links) Stereo-Ansicht des Komplexes zwischen dem Antibiotikum Tetrazyklin (gelb) und dem Tetrazyklin-Repressor. Dieser liegt als Dimer vor; die Polypeptidketten der beiden Monomere (blau und rot) sind in je 10 .alpha.-Helices gefaltet; .alpha.2 und .alpha.3 bilden Helix-Turn-Helix Motive, die an DNA binden. (Rechts) Detailansicht der Wechselwirkungen zwischen Tetrazyklin und Repressor. Wasserstoffbrückenbindungen und van der Waals Kontakte sind mit dünnen bzw. dicken gestrichelten Linien gekennzeichnet, Mg2+ ist mit Tetrazyklin, Histidin 100 und drei Wassermolekülen oktaedrisch koordiniert.

Photosystem I

Bei der Photosynthese wird Lichtenergie benutzt, um H2O in O2, Elektronen und H+ zu spalten. Dafür sind zwei Proteinkomplexe, die Photosysteme I (PSI) und II verantwortlich, die in die pflanzliche Thylakoidmembran eingebettet sind. PSI besteht aus 11 Proteinen, 3 Fe4S4-Clustern, 1 Vitamin K1 und ca. 100 Chlorophyll a Molekülen mit einer Gesamtmasse von 340 kDa und liegt als Trimer vor. Es gelang, diesen Komplex zu kristallisieren und die Struktur bei bisher 6 Å (d.h. nicht-atomarer) Auflösung zu beschreiben5, eine Publikation der Struktur bei 4 Å Auflösung ist in Vorbereitung (Abb. 2). Die beiden größten Proteine, .ap. 82 kDa, sind rotations-symmetrisch angeordnet. Sie durchspannen mit je 11 .alpha.-Helices die Membran, und auf der Symmetrie-Achse liegen die für die Elektronenleitung wesentlichen Pigmente: 6 Chlorophyll a, 1 Vitamin K1 und die drei Fe4S4 Cluster. Die .ap. 94 weiteren Chlorophyll a sind als Antennen außerhalb der beiden Proteine angeordnet, die anderen 9 wesentlich kleineren Proteine liegen an der Peripherie und als Verbindungsdomäne nahe der dreizähligen Symmetrieachse.


Abb. 2. Struktur des Photosystems I aus Synechococcus elongatus bei 4 Å Auflösung, in Aufsicht auf die Membranebene. Gezeigt sind .alpha.-Helices als Zylinder (die Verbindungen zwischen den .alpha.-Helices sind noch nicht klar), die Kopfgruppen der Chlorophylle (schwarz) und Fe4S4 Cluster (rote Würfel). Durch den mittleren Fe4S4 Cluster läuft eine lokale zweizählige Achse, die die beiden großen Untereinheiten A (blau) und B (grün) ineinander in Beziehung setzt. Entlang dieser Achse ist die Elektronenleiterkette angeordnet mit dem Donor P700 (Chlorophyll-Dimer), den Akzeptor-Chlorophyllen Aacc, Aacc' und Ao, Ao', einem Vitamin K (nicht gezeigt) und den drei Fe4S4 Clustern FA, FB, FX. Die rot und orange gefärbten .alpha.-Helices gehören zu 6 kleineren Untereinheiten je Monomer, und 3 weitere Untereinheiten (nicht gezeigt) liegen "über" den .alpha.-Helices. Die um die großen Untereinheiten gruppierten 68 Chlorophylle bilden eine Antenne, die Licht einfängt und zum Reaktionszentrum P700 leitet.

Cyclodextrin-Einschlußverbindungen

Cyclodextrine sind ringförmig geschlossene Oligosaccharide, die aus 6-8 .alpha.(1-4) verknüpften Glukosen bestehen. Sie bilden mit kleinen Molekülen, die in die 5-8 Å weiten internen Hohlräume passen, Einschlußverbindungen, die sich vorzüglich eignen, um nichtkovalente Bindungen im Detail zu studieren (Abb. 3). Weiter sind die Glukose-OH-Gruppen "außen" angeordnet und bilden O-H···O Wasserstoffbrücken aus, die, wie Neutronenbeugungs-Untersuchungen zeigten, in größeren Netzen kooperativ angeordnet und zum Teil dynamisch fehlgeordnet sind6,7. Da sich Cyclodextrin-Komplexe in höchster Auflösung mit Röntgen- wie auch mit Neutronendiffraktion kristallographisch analysieren lassen, ergeben sich detaillierte Einblicke in diese für biologische Systeme so wesentlichen Kräfte.


Abb. 3. Struktur des Komplexes .beta.-Cyclodextrin·Ethanol·8H2O, mit Neutronendiffraktion bei 15 K bestimmt. O-Atome gepunktet, H und C als kleine bzw. größere Kugeln. O-H···O und C-H···O Wasserstoffbrücken mit dünnen Linien bzw. dick gepunktet gezeichnet, Abstände H···O in (Å), Winkel C-H···O in (°); der Abstand H(5)1···W6 ist lang und deshalb dünn gepunktet. C-H···O Kontakte werden in diesem Komplex gebildet zu Sauerstoffatomen, die ihr Wasserstoffbrücken-Potential nicht mit O-H···O Kontakten absättigen können. Aus Th. Steiner, W. Saenger, JACS 1992, 114, 10146.

Lineare Oligosaccharide

Oligosaccharide sind notorisch schwierig zu kristallisieren. Es gelang trotzdem, die Strukturen je eines Oligomers der Stärke (Maltohexaosid) und der Cellulose (Cellotetraose) mit kristallographischen Methoden aufzuklären. Das Maltohexaosid bildet mit Trijodid einen Komplex, in dem es als linksgewundene, antiparallele Doppelhelix vorliegt, in deren inneren Hohlraum (analog Cyclodextrin) Trijodid-Polymere eingelagert sind8. Cellotetraose kristallisiert in einer Form, die für polymere Cellulose II charakteristisch ist. Die Strukturanalyse der winzigen Kristalle mit Synchrotron-Röntgenstrahlung erlaubte, die seit 70 Jahren untersuchte Struktur dieses Biopolymers im Detail aufzuklären9.

Aggregation und Kristallisation von Proteinen

Die Kristallisation von Proteinen erfolgt aus wäßriger Lösung nach Erniedrigung der Löslichkeit durch Zugabe von Salzen oder organischen Molekülen und ist bisher wenig verstanden. Wie Lichtstreu-Messungen zeigten, aggregieren die Proteine unter Kristallisationsbedingungen zunächst zu großen Clustern mit fraktaler Struktur. Die Kinetik des Wachstums der Cluster läßt erkennen, ob schließlich amorphes Präzipitat oder Kristalle des jeweiligen Proteins erhalten werden. Diese Studien werden in Kooperation mit thermodynamisch, kalorimetrisch, mikroskopisch und theoretisch arbeitenden Gruppen weiter ausgedehnt, um zu verstehen, wie die Bildung der Kristallkeime positiv beeinflußt werden kann10.

Literaturliste

  1. D. Kostrewa, J. Granzin, Ch. Koch, H.-W. Choe, S. Raghunathan, W. Wolf, J. Labahn, R. Kahmann, W. Saenger. Nature 1991, 349, 178-180.
  2. W. Hinrichs, C. Kisker, M. Düvel, A. Müller, K. Tovar, W. Hillen, W. Saenger. Science 1994, 264, 418-420.
  3. G. Müller, B. Hecht, V. Helbl, W. Hinrichs, W. Saenger, W. Hillen. Nature Struct. Biol. 1995, 2, 693-703.
  4. J. Labahn, J. Granzin, G. Schluckebier, D. P. Robinson, W. E. Jack, I. Schildkraut, W. Saenger. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 10957-10961.
  5. N. Krauß, W. Hinrichs, I. Witt, P. Fromme, W. Pritzkow, Z. Dauter, Ch. Betzel, K.S. Wilson, H.T. Witt, W. Saenger. Nature 1993, 361, 326-331.
  6. G. A. Jeffrey, W. Saenger. Hydrogen Bonding in Biological Structures. Springer-Verlag Heidelberg, 569 pp., 1991.
  7. Th. Steiner, A. M. Moreira da Silva, J.J.C. Teixeira-Dias, J. Müller, W. Saenger. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 1452-1453.
  8. W. Hinrichs, G. Büttner, Ch. Betzel, V. Zabel, B. Pfannemüller, W. Saenger. Science 1987, 238, 205-208.
  9. K. Geßler, N. Krauß, Th. Steiner, Ch. Betzel, C. Sandmann, W. Saenger. Science 1994, 266, 1027-1029.
  10. Y. Georgalis, J. Schüler, J. Frank, M. D. Soumpasis, W. Saenger. Adv. Colloid and Interface Sci. 1995, 58, 57-86.

Weitere Verweise


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© 1996, Redaktionsschluß: 1996-08-01.