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3.10 Prof. Dr. Udo Heinemann

Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin

Institut für Kristallographie

Biochemie, Kristallographie, Struktur- und Molekularbiologie

Keywords: macromolecular crystallography, protein and nucleic-acid structure.


MDC: Robert-Rössle-Str. 10, 13122 Berlin; Tel. +49 30 9406-3420. E-mail: heinemann@mdc-berlin.de

Abstract

Owing to the rapid progress of recent years in the fields of cell and molecular biology a growing number of cellular processes can be studied at the submolecular and even atomic level. It is generally accepted that function is determined by the three-dimensional structures of biological macromolecules. The universal method to establish the tertiary and quaternary structures of proteins and nucleic acids in a wide range of sizes and at high resolution is X-ray crystallography. We are using this method mainly to address problems in the areas of protein-nucleic acid interaction, enzymology, and protein folding and stability. Over recent years we have focused on structural studies of synthetic nucleic acid molecules, several classes of DNA-binding proteins, and the "jellyroll" protein domain which illustrates important aspects of protein folding.

Wissenschaftlicher Werdegang

Promotion: Georg-August-U., Göttingen (1982); Postdok.: Max-Planck-Inst. für experimentelle Medizin, Göttingen (1982); Postdok.: UCLA, Los Angeles, USA (1982-1985); Hochschulass.: FU Berlin (1985-1991); Habil.: Inst. f. Kristall., FU Berlin (1989); Heisenberg-Stipendiat der DFG am Inst. für Kristall., FU Berlin (1991-1993); Vertret. der Prof. für Org. Strukturchem.: U. Stuttgart (1992-l993); Ruf auf die Prof. (C4) für Biochemie U. des Saarlandes, Saarbrücken, abgelehnt (1993); Leiter der Forschungsgruppe Kristallographie: Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin, Berlin (seit 1993); Prof. für Proteinkristallographie: Inst. für Kristallographie, FU Berlin (seit 1995).

Kooperationspartner

Prof. Dr. Rainer Borriss, Institut für Genetik und Mikrobiologie, HU zu Berlin; Prof. Dr. Volker A. Erdmann, Inst. für Biochem., FU Berlin; Dr. Mathias Gaestel, Max-Delbrück-Centr. für Molekul. Med., Berlin; Prof. Dr. Claudio O. Gualerzi, Dept. of Biol., U. of Camerino, Italien; Prof. Dr. Ulrich Hahn, Inst. für Biochem., U. Leipzig; Prof. Dr. Detlev Krüger, Inst. für Virologie, Charité, HU zu Berlin; Dr. Erich Lanka, Max-Planck-Inst. für Molekul. Genetik, Berlin; Prof. Dr. Mohamed A. Marahiel, FB Chemie, Biochemie, Philipps-U. Marburg; Prof. Dr. Antoni Planas, CETS Inst. Quimic de Sarrià, U. Ramón Llull, Barcelona, Spanien; Prof. Dr. John N. Reeve, Dept. of Microbio., Ohio State U., Columbus, OH, USA; Dr. Heinz Sklenar, Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin, Berlin; Prof. Dr. Mathias Sprinzl, Lehrstuhl für Biochem., U. Bayreuth; Dr. Karl K. Thomsen, Dept. of Physiology, Carlsberg Laboratory, Copenhagen, Dänemark; Prof. Dr. Heinz Welfle, Charité, HU zu Berlin und Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin, Berlin; Prof. Dr. Brigitte Wittmann-Liebold, Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin, Berlin.

Drittmittelgeber

DFG Sfb 344 "Regulationsstrukturen von Nukleinsäuren und Proteinen". Schwerpunktprogramm "Molekulare Grundlagen der Funktion und enzymatischen Aktivität von Ribonukleinsäuren (RNA-Biochemie)"; Graduiertenkolleg "Modellstudien zu Struktur, Eigenschaften und Erkennung biologischer Makromoleküle"; Normalverfahren; Fonds der Chemischen Industrie.

Forschungsgebiete

Nukleinsäurestruktur

Nukleinsäuren sind hochgradig polymorphe Moleküle. Selbst innerhalb der kanonischen A-, B- und Z-Formen nach Watson und Crick basengepaarter Doppelhelices gibt es weitgehende, sequenz- und umgebungsabhängige Perturbationen der Konformation, die auf verschiedenen Ebenen der Protein-Nukleinsäurewechselwirkung von Bedeutung sein können. Diese Feinheiten der Struktur werden durch Kristallstrukturanalyse synthetischer Oligonukleotide erkannt. Seit mehreren Jahren bestimmt unsere Gruppe Kristallstrukturen von DNA-Fragmenten. Wir haben damit geholfen. das Ausmaß der Variabilität und die wechselseitigen Abhängigkeiten von Strukturparametern doppelhelikaler DNA aufzuzeigen. Auf der mehr technischen Seite konnten wir zeigen, daß die Kristallstrukturen von DNA durch Röntgenbeugungsmethoden sehr zuverlässig bestimmt werden können und weitgehend unabhängig von den angewandten analytischen Verfahren sind. Andererseits ist aber auch klar geworden, daß Umgebungseinflüsse, wie Ionenstärke und Kristallpackung, die Konformation der DNA mindestens in gleichem Maß beeinflussen wie die Nukleotidsequenz. Aus diesem Grund ist es ausgesprochen schwierig, von Kristallstrukturen auf das Verhalten von DNA-Fragmenten in biologischen Zusammenhängen zu extrapolieren. Hauptsächlich wegen der unterschiedlichen Struktur ihres Zucker-Phosphat-Rückgrats weist die RNA ein größeres Potential zur Ausbildung intra- und intermolekularer tertiärer Wechselwirkungen auf. Sie reagiert daher wenig empfindlich auf Umgebungseinflüsse und besitzt die Fähigkeit zur enzymatischen Katalyse chemischer Reaktionen. Aus diesem Grund verlagern wir unseren Forschungsschwerpunkt jetzt mehr auf das Gebiet der RNA-Strukturen. Als ersten Schritt in diese Richtung haben wir die Kristallstruktur eines doppelhelikalen RNA-Moleküls bestimmt, welches die Shine-Dalgarno-Sequenz von Escherichia coli enthält (Abbildung 1).


Abb. 1. Stereographische Darstellung der Kristallstruktur eines synthetischen RNA-Moleküls mit Sequenz 5'-UAAGGAGGUGAU-3'/5'-AUCACCUCCUUA-3'. Der pyrimidinreiche Gegenstrang besitzt die Sequenz des 3'-Endes der 16S ribosomalen RNA von Escherichia coli. Die kursiv gedruckten Nukleotide repräsentieren die Konsensus-Sequenz der Shine-Dalgarno-Wechselwirkung von Escherichia coli. Diese spielt bei der Bindung der mRNA an das Ribosom während der Initiation der Proteinbiosynthese eine wichtige Rolle. Die Abbildung zeigt die colineare Anordnung zweier doppelhelikaler Fragmente von jeweils 12 Basenpaaren Länge im Kristall.

Strukturanalyse der ubiquitären Kälteschockdomäne

Die Kälteschockdomäne (cold shock domain, CSD) ist ein kompaktes Strukturelement von circa 70 Aminosäureresten. Sie kommt in Proteinen aus vielen verschiedenen Organismen, von Escherichia coli bis zum Menschen, vor. In den Y-Box-Faktoren höherer Eukaryoten stellt sie die für Nukleinsäurebindung verantwortliche funktionelle Domäne dar, während die bakteriellen Kälteschockproteine lediglich aus einer CSD bestehen. Die Synthese von CspA, dem hauptsächlichen Kälteschockprotein von Escherichia coli, wird durch abrupte Senkung der Wachstumstemperatur induziert. Das Protein wirkt dann als transkriptioneller Aktivator auf andere Kälteschockgene. Als Modell für die ubiquitäre CSD haben wir die Kristallstruktur des CspA, ebenso wie die des homologen CspB von Bacillus Subtilis, bestimmt (Abbildung 2). Beide Proteine falten zu kompakten, fünfsträngigen .beta.-Faßstrukturen mit "Greek Key"-Topologie und weisen Oberflächensignaturen auf, die für Proteine typisch sind, welche an einzelsträngige Nukleinsäuren binden. Eine bevorzugte Bindung an DNA-Einzelstränge konnte in Gelretardationsessays auch tatsächlich nachgewiesen werden. Während CspA im Kristall monomer vorliegt, bildet CspB in verschiedenen Kristallformen symmetrische .alpha.2-Homodimere. Ob dies von funktioneller Wichtigkeit ist, muß noch bestimmt werden. Um unsere Untersuchungen der CSD von Bakterien zu Eukaryoten auszudehnen haben wir begonnen, den Y-Box-Faktoren homologe Proteine in Hefen zu suchen, wo sie noch nicht beschrieben wurden.



Abb. 2. Kristallstruktur des Kälteschockproteins CspB von Bacillus subtilis. Oben ist das dimere Protein schematisch gezeigt; die Pfeile symbolisieren .beta.-Faltblattstränge. Die Ausbildung der Kontakte zwischen den Untereinheiten durch Wasserstoffbrücken (gestrichelt) zwischen den Strängen .beta.4 ist im Detail unten gezeigt.

Protein-DNA-Wechselwirkung bei der Chromatinorganisation

In jedem Organismus muß die chromosomale DNA in einem kondensierten Zustand gehalten werden, dessen Regulation von zentraler funktioneller Bedeutung ist. Nachdem wir einige Jahre bakterielle "histonähnliche" Proteine untersucht haben - diese Proteine sind mit den Histonen nicht homolog und weisen ganz verschiedene physikalische Eigenschaften auf - haben wir uns kürzlich einfachen Modellen für die eukaryotischen "Core"-Histone zugewandt. Diese Proteine finden sich in einigen Archaebakterien wie dem Methanothermus fervidus, in dem zwei eng verwandte Histonproteine, HMfA und HMfB, vorkommen. Beide sind den eukaryotischen Kernhistonen homolog, wobei die Sequenzübereinstimmung am deutlichsten gegenüber dem Protein H4 ausgeprägt ist. Sie repräsentieren daher das basale Faltungsmotiv der Kernhistone. Diesen gegenüber bieten sie den Vorteil, daß sie leicht in stabiler Form isoliert werden können und vielen physikalischen Untersuchungen zugänglich sind. Es ist uns kürzlich gelungen, sowohl von HMfA als auch von HMfB Kristalle zu züchten, die zu sehr hoher Auflösung diffraktieren und damit die Möglichkeit zu einer detaillierten strukturellen Charakterisierung des Faltungsmotivs der Kernhistone bieten. Eine erste Struktur konnte bereits bestimmt werden.

.beta.-Glucanasen und zirkuläre Permutationen von Proteindomänen

.beta.-Glucan ist ein überwiegend lineares Polysaccharid mit einem ungefähren Verhältnis von 2 zu 1 zwischen .beta.-1,4 und .beta.-1,3-glycosidischen Verknüpfungen. Es kommt hauptsächlich in den Zellwänden von Getreidepflanzen vor, wo es die gespeicherte Amylose vor Abbau schützt. Der Zugang zur Amylose während der Keimung und in biotechnologischen Prozessen erfordert den Abbau des .beta.-Glucans durch .beta.-Glucanasen, welche spezifisch diejenigen .beta.-1,4-Verknüpfungen hydrolysieren, die .beta.-1,3-Bindungen benachbart sind. Wir haben die Kristallstruktur der .beta.-Glucanase aus Gerste und verschiedener bakterieller Enzyme bestimmt und dabei funktionell wichtige Aminosäuren in den aktiven Zentren identifiziert und den enzymatischen Mechanismus, weitgehend aufgeklärt. Obwohl pflanzliche und bakterielle Enzyme die gleiche Reaktion mit der gleichen Substratspezifität katalysieren, ist ihre molekulare Struktur völlig unterschiedlich. Auf der Grundlage einer Strukturanalyse bei einer Auflösung von 1.6 Å in Verbindung mit molekularer Modellierung konnten die strukturellen Grundlagen der Substratspezifität der bakteriellen .beta.-Glucanasen bestimmt und mehrere Mutationen vorgeschlagen werden, welche die Spezifität ändern könnten (Abbildung 3). Über ihre biotechnologische Bedeutung hinaus haben sich die bakteriellen .beta.-Glucanasen als wertvolle Modelle erwiesen, an denen Aspekte des Proteinfaltungsprozesses studiert werden können. In der Abbildung wird das Prinzip der Faltung der Proteine in eine kompakte, vollständig antiparallele "Jellyroll"-Faltblattdomäne deutlich, aus der N- und C-Terminus der Polypeptidkette in enger räumlicher Nachbarschaft hervorschauen. Diese dreidimensionale Struktur erlaubte die Durchführung einer zirkulären Permutation der Sequenz, wobei formell N- und C-Terminus durch eine Peptidbindung verknüpft und neue Enden an anderer Stelle an der Proteinoberfläche geschaffen wurden. Tatsächlich wurde diese Permutation durch Umorganisation des proteinkodierenden Gens bewirkt. Durch Kristallstrukturanalyse konnte gezeigt werden, daß das resultierende Protein nicht nur enzymatisch aktiv und stabil gefaltet ist, sondern auch eine räumliche Struktur einnimmt, die von der des parentalen Proteins kaum zu unterscheiden ist. Im Gegensatz zu populären Überzeugungen belegt dieses Experiment, daß - zumindest für Proteine dieses Strukturtyps - dem nativen N-Terminus der Polypeptidkette keine zentrale Bedeutung für den Faltungsprozeß zur nativen Konformation des Proteins zukommt.


Abb. 3. Modell der Bindung eines hexameren .beta.-Glucanfragments an eine bakterielle .beta.-Glucanase. Das Substrat bindet in eine tiefe Furche an der Oberfläche des Enzyms, an deren Boden zwei Glutaminsäuren lokalisiert sind, die für die Katalyse der Substratumsetzung verantwortlich sind. Das Protein ist schematisch mit Pfeilen für Faltblattstränge dargestellt, die Atome des Oligosaccharids sind raumerfüllend gezeichnet.

Literaturliste

  1. U. Heinemann, M. Hahn. "C-C-A-G-G-C-m5C-T-G-G: Helical fine structure, hydration, and comparison with C-C-A-G-G-C-C-T-G-G". J. Biol. Chem. 1992, 267, 7332-7341.
  2. U. Heinemann, C. Alings, M. Bansal. "Double helix conformation, groove dimensions and ligand binding potential of a G/C stretch in B-DNA". EMBO J. 1992, 11, 1931-1939.
  3. T. Keitel, O. Simon, R. Borriss, U. Heinemann. "Molecular and active-site structure of a Bacillus (1-3,1-4)-.beta.-glucanase". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90, 5287-5291.
  4. H. Schindelin, M.A. Marahiel, U. Heinemann. "Universal nucleic acid-binding domain revealed by crystal structure of the B. subtilis major cold-shock protein". Nature 1993, 364, 164-168.
  5. H. Schindelin, W. Jiang, M. Inouye, U. Heinemann. "Crystal structure of CspA, the major cold shock protein of Escherichia coli". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 5119-5123.
  6. M. Hahn, K. Piotukh, R. Borriss, U. Heinemann. "Native-like in vivo folding of a circularly permuted jellyroll protein shown by crystal structure analysis". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 10417-10421.
  7. M. Hahn, O. Olsen, O. Politz, R. Borriss, U. Heinemann. "Crystal structure and site-directed mutagenesis of Bacillus macerans endo-1,3-1,4-.beta.-glucanase". J. Biol. Chem. 1995, 270, 3081-3088.
  8. H. Schindelin, M. Zhang, R. Bald, J.-P. Fürste, V.A. Erdmann, U. Heinemann. "Crystal structure of an RNA dodecamer containing the Escherichia coli Shine-Dalgarno sequence". J. Mol. Biol. 1995, 249, 595-603.
  9. U. Heinemann, M. Hahn. "Circular permutations of protein sequence: not so rare?" Trends Biochem. Sci. 1995, 20, 349-350.
  10. U. Heinemann, M. Hahn. "Circular permutation of polypeptide chains: Implications for protein folding and stability". Prog. Biophys. Mol. Biol., 1996, im Druck.

Weitere Verweise


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© 1996, Redaktionsschluß: 1996-08-01.